ВЭЖХ-анализ пептида — как читать хроматограмму

Короткий ответ. ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография, HPLC) разделяет компоненты образца по тому, как долго они удерживаются в колонке. Результат — хроматограмма: каждый пик — отдельный компонент, а чистоту пептида считают как долю площади основного пика в сумме всех пиков.

Как проходит анализ

Образец лиофилизата растворяют в подвижной фазе — обычно воде с 0,1% трифторуксусной кислоты.
Образец подают в обращённо-фазовую колонку C18 (сорбент с привитыми октадецильными группами).
Доля ацетонитрила в подвижной фазе растёт по градиенту, и компоненты выходят по очереди: более гидрофобные — позже.
УФ-детектор регистрирует поглощение пептидной связи при 214–220 нм.
Программа интегрирует пики: чистота = площадь основного пика / сумма площадей × 100%.

Что должно быть в отчёте ВЭЖХ

Элемент отчёта	Зачем
Хроматограмма (график)	Цифру без графика проверить нельзя
Колонка: тип, размер, размер частиц	Результат зависит от колонки
Подвижные фазы и градиент	Нужны, чтобы повторить анализ
Длина волны детекции	214–220 нм — стандарт для пептидной связи
Время удерживания основного пика	По нему сравнивают партии между собой
Таблица пиков с площадями	Видно, из чего сложился процент
Номер партии и дата анализа	Связь с конкретным флаконом

Как читать хроматограмму за минуту

Один высокий узкий пик и мелкие пики рядом — обычная картина.
«Плечо» на основном пике — возможна близкая примесь, которая плохо отделилась.
Широкий размытый пик — проблемы разделения или деградация образца.
Есть шкала времени и подписи осей — график снят на приборе, а не нарисован.

Чего ВЭЖХ не показывает. Метод не говорит, какая именно молекула в основном пике — это подтверждает масс-спектрометрия. Примеси, которые выходят вместе с основным пиком или не поглощают в УФ, в процент не попадают. Поэтому в COA ВЭЖХ и МС идут вместе, часто как связка ВЭЖХ-МС.

Как это устроено в BioPeptidePlus. Чистота по ВЭЖХ указывается в COA каждой партии.

Частые вопросы

ВЭЖХ и HPLC — это одно и то же?

Да, русская и английская аббревиатуры одного метода.

Почему разные лаборатории дают разную чистоту одной партии?

Разные колонки, градиенты и правила интегрирования пиков дают небольшое расхождение; сравнивать корректно только при одинаковой методике.

Что такое ВЭЖХ-МС?

Связка приборов: хроматограф разделяет компоненты, масс-спектрометр сразу измеряет массу каждого пика.

Источники

Mant C. T., Chen Y., Yan Z. et al. HPLC analysis and purification of peptides. Methods Mol Biol. 2007;386:3–55.
ICH Q2(R2) — валидация аналитических методик (ich.org).